图1Digital-SMLM网络定位误差及结果展示
(a)针对亚衍射极限光斑的两个发射分子的不同距离，Digital-SMLM的不同均方根误差。(b)Digital-SMLM预测亚衍射极限光斑的分子位置的三个不同实例的效果展示。此处分子实际距离为分别为29.90nm、22.33nm和25.74nm；分子真实位置（Ground truth）在每个例子右上图以绿色叉表示，相应Digital-SMLM预测位置在每个例子左下图以红色叉表示；最右侧为放大图像，黄色叉是红色叉与绿色叉完全重合的效果、表示真实坐标和Digital-SMLM预测坐标完全吻合。比例尺：60nm。
1.导读
在生物医学研究中，在纳米尺度上对细胞超微结构中的目标分子进行精确定位非常重要，它为揭示细胞内分子机制并开展定量分析提供不可代替的信息。然而，由于衍射极限的存在，处于亚衍射极限距离的两个或多个荧光分子同时发光形成的光斑高度重叠，无法被传统光学成像系统所分辨。为了分辨亚衍射极限距离的分子，目前通常需要借助单分子定位显微镜SMLM（Single Molecule Localization Microscopy），比如STORM或PALM；STORM依赖于特定荧光分子的闪烁和专用成像缓冲液，使衍射极限范围内的多个分子在长时程序列成像的不同帧中被分别精确定位，从而实现超高分辨。已有某些算法（例如DeepLoco或DECODE）能够为成像中相互有重叠的光斑提供定位，但是，针对于由亚衍射极限距离的两（多）分子同时发光形成的亚衍射极限光斑，这些方法的效果仍然不佳。
针对这一问题，近日深圳大学微纳光电子学研究院纳米光子学研究中心倪燕翔组联合周凌霄组在袁小聪教授大力支持下在Nanophotonics发表最新文章，建立了一种基于深度学习的新方法Digital-SMLM，可以准确预测形成亚衍射极限光斑的分子数目和精确位置，准确率高达98%，均方根误差低至14 nm。对于两分子同时发光形成的亚衍射极限光斑，即使其距离近至20-30 nm，Digital-SMLM能够准确预测出其数目和精确定位（图1）；Digital-SMLM的预测效果优于Deep-STORM。同时，该工作使用独立实验的数据集验证了Digital-SMLM的泛化能力。此外，针对高分子密度细胞超微结构STORM成像中可能出现的两（多）分子同时发光形成的亚衍射极限光斑，在其超分辨图像重构中引进Digital-SMLM能够矫正这些异常光斑的定位，从而补充了STORM、使其能够更精准地展示目标细胞结构的真实状态。
2.创新研究
图2 Digital-SMLM方法流程
为了迎接上述挑战，本工作没有采用文献常用的模拟光斑方式而选择从单分子成像实验获取的光斑作为训练集构建的基础，因为后者具备真实实验中光斑所具有的各种特征，而相应的发光分子位置可以通过对光斑进行二维高斯拟合而确定。研究者利用来自实验的单分子光斑及信息再进一步叠加获得多分子光斑及相应发光分子位置，数据集制作及训练方法流程如图2所示。
随后，研究人员考虑模型的训练方案，从理论上讲，目标检测算法是此类问题最直接的解决方案。然而，由于数据集包含高度重叠的荧光分子光斑，这使得目标检测算法中使用的方法不适合这类问题。因此，研究人员从另一个角度出发，将光斑识别及定位转换为分类和回归定位两个步骤。这种处理方法可以有效避免目标检测中高度重叠目标难以检测的问题，而基于分类和回归的方法已在许多计算机视觉任务中取得了令人瞩目的成果。因此，如图3所示，研究人员训练了两类网络，分别用于分类和回归定位。分类网络的目的是确定数据集中每幅光斑图像是由多少个分子同时发光产生的，这有助于确定要返回的坐标数量。然后，分类网络的输出将用于选择使用相应回归定位网络求解的坐标。为此，研究人员对现有的优秀的主干网络进行了微调。如图3所示，分类网络的输出层由一个全连接层和一个用于分类的SoftMax激活函数组成，而定位网络的输出则由全连接层降维至相应的维度直接输出坐标。因此分别需要训练能够定位由不同数量荧光分子同时发光形成光斑的定位网络。虽然这个过程可能比较费力，但这可以在由不同数目荧光分子同时发光形成的光斑图像中准确定位每个荧光分子的精确坐标，这种做法极大地提高了定位精度。
图3Digital-SMLM网络的训练过程
图4Digital-SMLM为亚衍射尺度的超微结构模拟STORM成像提供了荧光分子数量和荧光分子坐标
3.应用与展望
本工作提出的Digital-SMLM将可以应用到对高分子密度细胞超微结构STORM图像重构，弥补在这个具体场景中由于当前荧光分子闪烁特性的限制而可能导致的STORM序列图像中部分亚衍射极限光斑实际上由两（多）分子同时发光形成的问题，从而提高STORM展示细胞超微结构中目标分子真实组织形式的能力（图4）。尽管Digital-SMLM具有这些优势，但它更适用于细胞超微结构而非更大的生物结构。在接下来的研究中，研究人员的目标是训练更多的模型，使Digital-SMLM能够根据低分辨率光斑准确预测分子距离从几纳米到近千纳米场景下的分子数量和位置，从而扩大其适用范围。
4.作者及单位信息
该研究成果以“Digital-SMLM for Precisely Localizing Emitters within the Diffraction Limit”为题在线发表在Nanophotonics。
本文作者分别是ZHE JIA, LINGXIAO ZHOU, HAOYU LI, JIELEI NI, DANNICHEN, DONGFEI GUO, BO CAO, GANG LIU, GUOTAO LIANG, QIANWEN ZHOU,LINRUIGUO，XIAOCONG YUAN, YANXIANG NI，其中前三位作者贾喆、周凌霄、李浩玉为共同第一作者，倪燕翔为通讯作者；深圳大学为唯一完成单位。
Online链接：（https://www.degruyter.com/document/doi/10.1515/nanoph-2023-0936/html）
Nanophotonics：JCR一区。
